» Главная  » Биология  » Получение ИФА-конъюгатов на основе МКАТ

3.Получение ИФА-конъюгатов на основе МКАТ 2

3.1. Основные принципы 2

3.2.Конъюгация пероксидазы хрена (ПХ) с IgG 4

3.3.Конъюгация щелочной фосфатазы с IgG одноэтапным методом с использованием глутарового альдегида 6

3.4. Контроль качества конъюгатов 6

Оборудование и принадлежности 9

Буферы и растворы 9

Технологическая схема получения МКАТ 16

Получение иммуногена 16

Первичный скрининг гибридом в ИФА 16

Клонирование гибридных клеток 17

Получение асцитической мжидкости 17

Список литературы 18

3.Получение ИФА-конъюгатов на основе МКАТ

3.1. Основные принципы

Самостоятельное приготовление конъюгата антител с ферментом - задача, вполне посильная для любого квалифицированного специалиста. Основное условие ее успешного решения - наличие хорошей гипериммунной антисыворотки, главные критерии качества которой - специфичность и необходимый титр. Остальные этапы довольно просты. Самостоятельно приготовленные конъюгаты, как правило, дешевле коммерческих. Кроме того, некоторые конъюгаты нужной специфичности не выпускаются в виде коммерческих реагентов. При пересылке коммерческих конъюгатов практически всегда существует риск снижения или даже потери их активности из-за неоптимальных условий при транспортировке или в местах хранения, особенно при доставке в отдаленные от производителя страны. Поэтому качество коммерческих конъюгатов, также как и приготовленных самими исследователями, необходимо тщательно контролировать в той реакции, для которой он предназначен. Основываясь на перечисленных соображениях, многие предпочитают готовить конъюгаты самостоятельно. Приготовленный однажды конъюгат при правильном хранении сохраняет активность в течение нескольких лет. Наиболее часто применяют конъюгаты с антиглобулинами, которые могут служить универсальными реагентами для различных по специфичности реакций. В то же время конъюгировать с ферментом можно антитела любой специфичности и любого изотипа, в том числе моноклональные; необходимо лишь, чтобы они были доступны в достаточном количестве. С помощью описанной ниже методики можно приготовить конъюгат всего из 100 мкг антител. Эта же методика подходит и для присоединения ферментной метки к любому белковому антигену, однако в этом случае оптимальное соотношение между количеством фермента и сшивающего реагента необходимо подбирать индивидуально, методом проб и ошибок [10].

В настоящем разделе описано приготовление конъюгатов ферментов с бараньими и кроличьими антителами. Необходимое оборудование и реагенты перечислены в табл. 3.1. При работе с антителами других животных используют те же методики. Возможность применения того или иного метода зависит от выбранного фермента (см. табл. 3.1). Ниже описаны методики конъюгации антител с пероксидазой хрена (ПХ) и щелочной фосфатазой (ЩФ). Исходным материалом для приготовления конъюгата служит очищенная фракция IgG из гипериммунной сыворотки. Ее получают осаждением сульфатом аммония и последующей анионообменной хроматографией на целлюлозе DE-52.

1. Goding J. Monoсlonal antibodies. Principles and practice. Acedemic press, San Diego, 1996.

2. Ніколаєнко І.В. Отримання та порівняльний аналіз гібридом-продуцентів моноклональних антитіл, що диференціюють вакцинні та вірулентні поліовіруси І, ІІ та ІІІ типів: Дисертація ..... канд. мед. наук. - Київ, 1999. - 148 с.

3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с.

4. Галкин А.Ю., Николаенко И.В. Гибридомная технология: принцип и применение // Біотехнологія. Освіта. Наука: Тези доповідей учасників I Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих вчених (10-11 лютого 2003 р., м. Київ) / Укл.: І.В.Повстянко, О.Ю.Галкін. - К.: "Видавництво "Політехніка", 2003. - С.74 - 75.

5. Методичні вказівки до виконання організаційно-економічної частини дипломних робіт для студентів хіміко-технологічних спеціальностей всіх форм навчання / Укл.: В.В. Янковий, М.П. Дорошенко, І.О. Попов. - К.: НТУУ "КПІ", 1999. - 40 с.

6. Смирнов В.В., Сельникова О.П., Думанський В.Д., Мойсеєва Г.В., Гриневич О.Й. Імунобіологічні препарати. Довідник. К.: Моріон, 2001. - 192 с.

7. Фармацевтичний ринок України 2002 / Медичний ринок. - 2003. - №1. - С. 17 - 18.

9. Биотехнология. В 8 кн. / Под ред. Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова Кн. 3. Клеточная инженерия. / Р.Г.Бутенко, М.В.Гусев, А.Ф.Киркин и др. - М.: Высш. ш., 1987. - 127 с.

10. Bains W/ Biotechnology from A to Z.IRL Press, Oxford, England, 1998.

11. Goding J. Antibody production by hybridomas. - J. of immunol. Methods, 1980, - V.39. - P. 285-308.

12. Иммунологические методы / Под ред. Х.Фримеля. - М.: Мир, 1979. - 520 с.

13. Антитела. Методы: Кн.1: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти.- М. :Мир, 1991. - 287с.

14. Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа: Пер. с англ. / Под ред. Р.Г.Кеннета. - М. :Медицина, 1987. -416с.

15. Антитела. Методы: Кн.2: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти.- М. :Мир, 1991. - 320с.

16. Методы иммунохимического анализа в биологии развития (практическое руководство) / А.Т.Михайлов, В.Н.Симирский. - М.: Наука, 1991. - 288с.

Примечаний нет.

"Биохимия белка. Интерпретация биохимических исследований для диагностики животных" ( Контрольная работа, 15 стр. )
"Жизненные формы растений, понятие, история исследования и современная классификация" ( Курсовая работа, 21 стр. )
"Происхождение эукариотических клеток" 11 ( Курсовая работа, 25 стр. )
. В столовой при проверке условий и сроков хранения мясной продукции установлено е3242222 ( Контрольная работа, 15 стр. )
. Влияние химических веществ на микроорганизмы. Примеры практического использования 635252 ( Контрольная работа, 12 стр. )
. Дайте биохимическую характеристику избранного вида спорта (волейбол) по плану к2313131 ( Контрольная работа, 13 стр. )
. Дыхание микроорганизмов. Отличительные особенности аэробов, анаэробов. у35533 ( Контрольная работа, 19 стр. )
. Перед нами находятся плоды лекарственных растений Grataegus sanguinea (боярышник кроваво-красный), Aronia melanocarpa (черноплодная рябина), Rosa acicularis ( шиповник иглистый ), Vccinium mytillus ( черника обыкновенная). е34242 ( Контрольная работа, 12 стр. )
. ПИХТА ЦЕЛЬНОЛИСТНАЯ, ЧЕРНАЯ (СЕМЕЙСТВО СОСНОВЫЕ) 524134131 ( Контрольная работа, 14 стр. )
. Происхождение античного театра 007упц2ц ( Контрольная работа, 16 стр. )
.В чем сущность эволюционного учения Ч.Дарвина и каково его влияние на развитие биологической науки ( Контрольная работа, 13 стр. )
1. Классификация ферментов 2. Использование температуры для хранения пищевых продуктов ( Контрольная работа, 15 стр. )
1. Разгрузочно-диетическая терапия (голодание) 4п64 ( Контрольная работа, 14 стр. )
1. Формы воды в почве и степень ее доступности для растений 3 5653 ( Контрольная работа, 12 стр. )
2. Синтез белка в клетке. Транскрипция и синтез информационной РНК. Трансляция - сборка белковой молекулы при участии иРНК, тРНК и рибосом. 7 ( Контрольная работа, 14 стр. )
2. Синтез белка в клетке. Транскрипция и синтез информационной РНК. Трансляция - сборка белковой молекулы при участии иРНК, тРНК и рибосом. 7 2011-14 ( Контрольная работа, 14 стр. )
2.Исследование микрофлоры 2.Исследование микрофлоры Исследование микрофлоры ( Контрольная работа, 13 стр. )
3. Спорообразование и роль спор микроорганизмов . Значение данного фактора при производстве и хранении продуктов 3 -к345 ( Контрольная работа, 14 стр. )
5. Архитектура античного театра 12кй4141 ( Контрольная работа, 7 стр. )
5. Архитектура античного театра 12в2411 ( Контрольная работа, 20 стр. )
6112216(б).doc =па ( Контрольная работа, 1 стр. )
6112217 (к) к.р. Биохимия Теория 10 А4 Ответить на основе вида спорта - волейбол: 1311 ( Контрольная работа, 1 стр. )
6122502(г) К.р. ботаника-2 Объем: 12 А4 теория (6 вопросов разн.) 131331 ( Контрольная работа, 2 стр. )
Clostridium botulinum – возбудитель пищевых токсикозов ( Курсовая работа, 18 стр. )
Jпределение возрастных особенностей питания большеглазого пузанка в естественных условиях ( Дипломная работа, 64 стр. )


                                          /  8 (495) 971-76-12  /  info@refport.ru  /     ¤